Sein Enkel und Nachfolger im Reich, Kaiser Karl V. (1500-1558), sah sich gewaltigen Konflikten gegenüber, die in einer Generation nicht gelöst werden konnten.

Nach Karl V. sollte kein Kaiser mehr über so ein großes Gebiet herrschen: die habsburgischen Stammlande, Burgund und Spanien mit seinen überseeischen Besitzungen. Sein Ideal war die kaiserliche Universalgewalt, sein Ziel war die Schaffung einer einheitlichen Christenheit. Das Scheitern seiner Mission liegt weniger in ihm selbst begründet als vielmehr an der Grundproblematik seiner Aufgaben. Das Reich wurde vom Südosten immer konkreter durch das expandierende osmanische Großreich bedroht. Als König von Spanien hatte Karl entsprechende Interessen im Mittelmeerraum und im Maghreb. Als Herr der Niederlande musste er aufgrund der vielfältigen Handelsbeziehungen zwischen Frankreich und England achten, was wegen der Feindschaft des französischen Königs fast ein Ding der Unmöglichkeit war. Und schließlich drohte dem Reich die Glaubensspaltung, der er nicht Herr werden konnte, auch wegen der mangelnden Unterstützung des Papstes.

Am Ende resignierte er und legte die Krone nieder. Sein Sohn Philipp erbte die Herrschaft in Spanien, sein Bruder Ferdinand trat Karls Nachfolge in Österreich an. 

Das mächtige Reich Karls V. wurde in die österreichische und in die spanische Linie des Hauses aufgeteilt. Es war das Familienunternehmen Europas. Die spanische Linie war lange Zeit die mächtigere, aber die Zukunft des Hauses lag auf der österreichischen Seite. Spanien war unermesslich reich dank der überseeischen Besitzungen und eine klassische Seefahrernation. Die Österreicher konnten da als Binnenmacht nicht mithalten, auch wenn sie die Reichskrone innehatten. Sie waren eine Art arme Verwandtschaft und lange galten die Spanier als die oberste Autorität des Hauses. Die Einheit des Hauses wurde gesichert durch enge familiäre Bindungen. Bis tief in das 17. Jahrhundert hinein wurden zwischen Madrid und Wien die Töchter ausgetauscht, um ihre Vettern oder Onkel zu heiraten. Diese Staatsheiraten waren ein wesentliches Element der dynastischen Machtpolitik im Zeitalter der Formierung neuer Großmächte.

Zeit der Glaubenskriege und Bedrängnis durch die Türken  

Ferdinand I., der Bruder Karls V., versuchte erfolgreich die Nachfolge für seinen Sohn Maximilian im Reich zu organisieren, trotz anderslautender innerfamiliärer Absprachen. Die Reichskrone blieb in den Händen bzw. auf den Häuptern des österreichischen Familienzweiges. Maximilian II. betrieb in seinem Herrschaftsgebiet vor allem eine Politik des religiösen Ausgleichs, sympathisierte er doch mit dem Protestantismus. Während es in ganz Europa zu religiös motivierten Auseinandersetzungen kam, blieb es in Österreich und Böhmen relativ ruhig. Wie nur wenige seiner Zeit sah Maximilian II. die schweren Folgen voraus, die sich aus den Glaubenskämpfen für das ganze Reich ergeben mussten. Empörend war für ihn, daß der Papst und der König von Spanien (sein eigener Vetter!) Feldzüge gegen Christen führten, aber für die Abwehr der Türken keinerlei Unterstützung gewährten. Selbst blieb er erfolglos im Kampf gegen die Türken, die einen Großteil Ungarns besetzt hielten und war schließlich gezwungen, 1568 mit dem Sultan den Frieden von Adrianopel zu schließen.  

Weniger in der Politik und bei Feldzügen fand sein Nachfolger Rudolf II. sein Glück. Er war einer der seltsamsten Habsburger, mit großen Begabungen, vor allem im künstlerischen, wissenschaftlichen und sprachlichen Bereich, aber politisch völlig uninteressiert. Sein Interesse galt vor allem der Kunst. Noch heute legen seine Sammlungen im Kunsthistorischen Museum in Wien Zeugnis ab von seinem Mäzenatentum und Kunstverständnis. Sein Hof in Prag war ein europäisches Kulturzentrum. Rudolfs politische Untätigkeit verschärfte die Krise im Reich so sehr, dass sein Bruder Matthias offen gegen ihn opponierte.  

Kaiser Ferdinand II. und Kaiser Ferdinand III. waren die Kaiser des 30jährigen Krieges, der zum 100jährigen Jubiläum der Reformation ausbrach und über drei Jahrzehnte hinweg Mitteleuropa verwüsteten. Für die österreichischen Habsburger kam nun die Zeit, in der sie von den absteigenden Spaniern die Hauptlast des Kampfes sowohl gegen die Türken im Südosten als auch gegen die Franzosen im Westen übernehmen sollten. Es war die zeit der triumphierenden Gegenreformation, des üppigen Barocks, in der sich Österreich zur Großmacht entwickelte. Kaiser Leopold I., auch „Türkenpoldi“ genannt, kam die Herausforderung der großen Türkenbelagerung Wiens 1683 zu. Dem Entsatzheer unter der Führung von Herzog Karl von Lothringen und dem polnischen König Jan III. Sobieski gelang am 12. September 1683 die Befreiung Wiens und fügte den türkischen Truppen eine vernichtende Niederlage zu. Für Österreich begann nun die Zeit des Wiederaufbaus. Der bis heute vorhandene barocke Glanz Wiens legt davon Zeugnis ab.  

Der Spanische Erbfolgekrieg

Das 17. Jahrhundert war für die spanischen Habsburger hauptsächlich durch Niedergang gekennzeichnet. Nachdem vom letzten habsburgischen Spanier, Karl II., keine Nachkommen zu erwarten waren, begann der Kampf um die Vorherrschaft in Spanien. Der Kampf um das spanische Erbe entbrannte. Leopold I. schickte seinen zweiten Sohn Karl nach Barcelona und die europäischen Großmächte warfen sich in einen über zehn Jahre währenden, zermürbenden Krieg. Erst als Leopolds Nachfolger, Joseph I., im Jahr 1711 kinderlos starb, war die Entscheidung gefallen. Karl reiste zurück und wurde in Frankfurt zu Kaiser Karl VI. gekrönt. Im Frieden von Utrecht von 1713 fiel Spanien an die Bourbonen.  

Die Pragmatische Sanktion

Die Familie war nun im Mannesstamm ausgedünnt. Nach dem Tod Josephs I. und dem Ableben von männlichen Erben bereits im Kindesalter begann Kaiser Karl VI. nun, die Erbfolge seines Hauses zu regeln. Er hatte nurmehr Töchter. Mit der „Pragmatischen Sanktion“ von 1713 bestimmte er, daß seine älteste Tochter die Thronfolge in den habsburgischen Erbländern antreten sollte. Die Loslösung eines Erblandes vom Ganzen sollte verhindert werden, auch im Hinblick auf die dramatischen Ereignisse des Spanischen Erbfolgekrieges. Die Thronfolge einer Frau war in den habsburgischen Ländern ein Präzedenzfall. Karl suchte also, bei den europäischen Mächten die Anerkennung der Thronfolge für seine Tochter zu gewinnen.